2023年11月22日，浙江大學張波教授課題組研究成果，發表在Plant Physiology期刊上（影響因子7.4），文章題目為Transcription factor PpNAC1 and DNA demethylase PpDML1 synergistically regulate peach fruit ripening。該研究使用了DNA親和純化測序（DAP-seq）技術鑒定了PpNAC1轉錄因子的結合基序和靶基因。研究發現轉錄因子PpNAC1和DNA去甲基酶PpDML1協同調節桃果實中乙烯合成、果肉軟化和風味形成的分子機制。

果實成熟伴隨著顏色、質地和風味的巨大變化，并受到轉錄因子(TFs)和表觀遺傳因子的調控。植物的NAC轉錄因子（TF）家族對果實成熟過程的調控發揮著關鍵作用，但在桃果實成熟過程中的調控機制并不清楚。

研究發現， PpNAC1可直接激活多個果實成熟相關基因的表達，在番茄(Solanum lycopersicum) nor (non-ripening)突變體中的過表達PpNAC1可恢復果實的成熟，在桃果實中的瞬時過表達PpNAC1可誘導相關靶基因的表達。PpNAC1及其靶基因轉錄水平的增強與成熟過程中啟動子mCG甲基化的降低有關。DNA甲基化下降與DNA去甲基化酶1 (PpDML1) 轉錄增加呈負相關，PpNAC1可識別和激活DNA去甲基化酶1啟動子。這些結果表明，PpNAC1和PpDML1之間的正反饋回路直接調控了桃成熟和品質形成所需的多個基因的表達。

1.桃果實成熟過程中乙烯釋放、質地和風味的變化

在桃子果實成熟的S3到S5階段，乙烯合成的數量增加了約100倍，通過硬度下降來衡量軟化程度顯著降低。同時，有機酸的含量顯著減少，總含糖量隨著果實成熟而增加。在早期階段，C6醛和醇含量減少，而揮發性酯和內酯含量增加，果實呈現出“果香"和“桃香"氣味。外源乙烯處理加速了果實軟化，促進了酯類和內酯類的合成，而1-MCP作為乙烯感知和作用的特異性抑制劑，則抑制了果實軟化和揮發物的合成。

2.NAC家族成員PpNAC1與桃果實成熟有關

桃子中含有115個NAC成員，系統發育分析顯示，其中有9個成員與其他已知與成熟相關的NAC聚集在一起，包括PpNAC1和PpNAC2。RNA-seq分析表明，PpNAC1的轉錄水平在果實成熟期間逐漸增加，并在成熟后保持在高水平，而PpNAC4和PpNAC5的轉錄水平卻相反。其他NAC成員的豐度相對較低。與對照和1-MCP處理相比，外源乙烯處理顯著增加了PpNAC1的轉錄水平。

根據MADS-RIN在番茄中的重要調控作用，分析了MADS家族成員在桃中的轉錄水平。其中有10個成員與MADS-RIN同源，其中4個成員轉錄水平較高，但與桃子成熟過程中乙烯的產生呈負相關，其他6個成員幾乎不表達。因此，結合本實驗和作者之前的研究，最終選擇PpNAC1作為候選TF，探索桃果實成熟的調控機制。

圖1. 桃果實成熟過程中乙烯釋放量、果實硬度、糖、酸和揮發物以及NAC成員轉錄水平的變化。

3.結合DAP-seq和RNA-seq鑒定PpNAC1的靶基因

作者通過DNA親和純化測序（DAP-seq）技術鑒定了PpNAC1的靶基因，通過兩次技術重復在基因組上共獲得了9238個結合位點，PpNAC1的結合位點主要位于轉錄起始位點（TSS）上游的500bp區域，24.3%（2245個基因）的PpNAC1結合位點位于的啟動子區（TSS上游2kb）。DAP-seq結果中的MEME分析顯示，ACG（T/C）（A/C）是PpNAC1的結合位點。在獼猴桃和香蕉的其他NAC轉錄因子中也觀察到了相同的結合基序。這些結果表明果實中NAC的結合基序是保守的。GO富集分析結果顯示，啟動子與PpNAC1結合的基因參與了果實的有機酸、蔗糖代謝等初級代謝過程，苯丙烷代謝、內酯代謝等次級代謝過程，激素代謝及反應，還與果實發育及防御反應過程有關。

為進一步篩選PpNAC1調控的桃子成熟過程中與果實品質相關的候選靶基因，結合RNA-seq數據，檢測到了2245個NAC結合位點基因。隨后，進行WGCNA和共表達網絡分析進一步挖掘PpNAC1靶基因PpACS1，PpACO1，PpPME1，PpPL1，PpPG1，PpSAD1，PpFAD3-1等。

圖2. 通過DAP-seq和RNA-seq對PpNAC1結合位點和靶基因進行全基因組分析。

 4.PpNAC1調節靶基因的驗證

通過雙熒光素酶報告實驗（DLR）驗證了PpNAC1對相關潛在基因靶點的轉錄激活作用，并展示了DAP-seq結果中PpNAC1與相關基因的結合峰。通過EMSA結果證實，PpNAC1可以在PpACS1、PpACO1，PpPL1，PpFAD3-1, PpAAT1和PpTST1的啟動子區與NACBS結合。這些結果表明，在果實成熟過程中，PpNAC1通過激活相關基因的轉錄，在乙烯合成和果實軟化過程中發揮著重要的調節作用。此外，這些結果還證明了DAP-seq在鑒定TF調節的靶基因方面的重要價值。

圖3. PpNAC1通過激活乙烯合成和果膠代謝相關基因的轉錄來調控果實的成熟和軟化。

圖4. PpNAC1通過激活VOCs合成和糖運輸相關基因的轉錄來調節水果風味。 

5.PpNAC1調控桃和轉基因番茄的果實軟化和風味

利用桃愈傷組織和轉基因番茄中的過表達來驗證PpNAC1對果實成熟、軟化和風味形成的調節作用。在桃愈傷組織中過表達PpNAC1促進了上述參與乙烯合成、果膠降解和揮發物合成過程的靶基因轉錄。在nor番茄突變體中過表達PpNAC1也基本可以恢復番茄nor突變體的乙烯合成和其他基因的表達缺陷，并促進果實成熟。

圖5. PpNAC1在桃愈傷組織中的瞬時過表達和在番茄中的穩定過表達均促進了果實成熟和風味發育相關基因的表達。

6.       PpNAC1靶基因啟動子區的DNA甲基化水平與果實成熟過程中的轉錄水平呈負相關

DNA甲基化是一種研究較為深入的表觀遺傳修飾，在調控果實成熟過程中發揮重要作用，也是導致表型變異的重要遺傳因子。全基因組甲基化測序（WGBS）分析顯示，啟動子區域mCG甲基化水平與成熟相關基因表達水平之間存在顯著的負相關。

圖6. 與果實成熟和風味形成相關的基因的全基因組甲基化譜和啟動子區甲基化水平。 

7.PpNAC1和DNA甲基化與桃果實成熟和風味形成有關

在番茄nor突變體果實中過表達PpNAC1促進了SlDML2的表達，此外，在桃愈傷組織中過表達PpNAC1可促進PpDML1的表達。DLR和EMSA檢測證實PpNAC1可以直接與PpDML1啟動子結合激活其轉錄。隨著果實成熟，PpNAC1啟動子區域的mCG甲基化水平下降，并與其轉錄水平呈負相關(r = -0.88)，其轉錄可能受到PpDML1介導的甲基化調控。

這些結果表明，桃子中PpNAC1和PpDML1之間存在一個正反饋回路，協同調控果實成熟。基于本研究的結果，作者構建了PpNAC1和PpDML1在果實成熟過程中的調控模型。

圖7. 桃果實成熟過程中PpNAC1和PpDML1在DNA去甲基化和成熟基因表達中的作用。

文章小結：

乙烯響應TFs和DNA甲基化在果實成熟和風味品質的調節中發揮著重要作用。本研究表明，PpNAC1通過靶基因的轉錄調控和表觀遺傳因子（如DNA甲基化）來調控果實成熟和風味品質。了解調控水果成熟和質量的表觀遺傳機制將為作物育種提供新的方向，并對改善水果質地和風味具有重大價值，對由于人口增長和飲食變化而不斷增長的全球糧食需求提供幫助。